เครื่องพิมพ์ชีวภาพต้นทุนต่ำ: 13 ขั้นตอน (พร้อมรูปภาพ)

2024 ผู้เขียน: John Day | [email protected]. แก้ไขล่าสุด: 2024-01-30 13:04

เราเป็นทีมวิจัยที่นำโดยระดับปริญญาตรีที่ UC Davis เราเป็นส่วนหนึ่งของ BioInnovation Group ซึ่งดำเนินการใน TEAM Molecular Prototyping and BioInnovation Lab (ที่ปรึกษา Dr. Marc Facciotti และ Andrew Yao, M. S.) ห้องปฏิบัติการนำนักเรียนที่มีภูมิหลังที่หลากหลายมาทำงานในโครงการนี้ (วิศวกรรมเครื่องกล/เคมี/ชีวเคมี)

เบื้องหลังเล็กน้อยของโครงการนี้คือเราเริ่มพิมพ์เซลล์ข้าวดัดแปรพันธุกรรมร่วมกับ Dr. Karen McDonald จากแผนก ChemE โดยมีเป้าหมายที่จะพัฒนาเครื่องพิมพ์ชีวภาพราคาประหยัดเพื่อให้สถาบันวิจัยสามารถเข้าถึงการพิมพ์ชีวภาพได้มากขึ้น ในปัจจุบัน เครื่องพิมพ์ชีวภาพระดับล่างมีราคาประมาณ 10, 000 ดอลลาร์ ในขณะที่เครื่องพิมพ์ชีวภาพระดับไฮเอนด์มีราคาประมาณ 170, 000 ดอลลาร์ ในทางตรงกันข้าม เครื่องพิมพ์ของเรามีราคาประมาณ 375 ดอลลาร์

เสบียง

อะไหล่:

1. ทางลาด 1.4:
2. Arduino mega 2560:
3. ไดรเวอร์สเต็ปเปอร์มอเตอร์:
4. สเต็ปเปอร์มอเตอร์เพิ่มเติม (อุปกรณ์เสริม)
5. คานชง 2 ใน X 1 นิ้ว
6. ฮาร์ดแวร์สิ่งที่แนบมากับคานผู้ผลิต
7. สกรู M3 คละขนาด
8. ถั่ว M3 x2
9. แกนเกลียว 8 มม.
10. น็อต 8 มม.
11. 608 แบริ่ง
12. คลิปหนีบกระดาษ
13. เส้นใย
14. Monoprice V2
15. ซิปรูด
16. น็อตชุดทำความร้อน M3 กว้าง 2 มม.

เครื่องมือ:

1. ดอกสว่านขนาดต่างๆ
2. สว่านมือ
3. สว่านกด
4. เลื่อยวงเดือน
5. หัวแร้ง + หัวแร้ง
6. เครื่องปอกสายไฟ
7. คีมจมูกเข็ม
8. ประแจหกเหลี่ยมขนาดต่างๆ

อุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ:

1. จานเพาะเชื้อ ~70mm เส้นผ่านศูนย์กลาง
2. กระบอกฉีดยาขนาด 60 มล. พร้อมปลายล็อค Luer
3. กระบอกฉีดยาขนาด 10 มล. พร้อมปลายล็อค Luer
4. อุปกรณ์ล็อค Luer
5. ท่อสำหรับฟิตติ้ง
6. T Connector สำหรับท่อ
7. เครื่องหมุนเหวี่ยง
8. หลอดหมุนเหวี่ยง 60ml
9. มาตราส่วน
10. เรือชั่งน้ำหนัก
11. หม้อนึ่งฆ่าเชื้อ
12. บีกเกอร์
13. กระบอกสำเร็จการศึกษา
14. สารละลาย CaCl2 0.1M
15. Agarose
16. อัลจิเนต
17. เมทิลเซลลูโลส
18. ซูโครส

ซอฟต์แวร์:

1. Fusion 360 หรือ Solidworks
2. Arduino IDE
3. โฮสต์ซ้ำ
4. Ultimaker Cura 4

ขั้นตอนที่ 1: การเลือกเครื่องพิมพ์ 3 มิติ

เราเลือก Monoprice MP Select Mini 3D Printer V2 เป็นเครื่องพิมพ์ 3 มิติเริ่มต้น เครื่องพิมพ์นี้ได้รับเลือกเนื่องจากต้นทุนต่ำและมีความพร้อมใช้งานสูง นอกจากนี้ เครื่องพิมพ์ 3 มิติที่มีความแม่นยำสูงก็มีวางจำหน่ายแล้ว ซึ่งทำให้การออกแบบง่ายขึ้น คำแนะนำนี้จะเหมาะสำหรับเครื่องพิมพ์เฉพาะนี้ แต่สามารถใช้กระบวนการที่คล้ายกันในการแปลงเครื่องพิมพ์ FDM ทั่วไปและเครื่อง CNC ได้

รุ่นความแม่นยำสูง:

ขั้นตอนที่ 2: การพิมพ์ 3 มิติ

ก่อนถอดประกอบเครื่องพิมพ์ Monoprice จะต้องพิมพ์ 3D หลายส่วนเพื่อดัดแปลงเครื่องพิมพ์ 3D มีเครื่องอัดรีดแบบวางหลายรุ่นซึ่งต้องใช้อีพ็อกซี่และอีกรุ่นที่ไม่ต้องการ แบบที่ต้องการอีพ็อกซี่จะมีขนาดกะทัดรัดกว่าแต่ประกอบยากกว่า

ขั้นตอนที่ 3: เตรียมเครื่องพิมพ์สำหรับการปรับเปลี่ยน

ควรถอดแผงทาวเวอร์ด้านหน้า ฝาครอบด้านล่าง และแผงควบคุมออก เมื่อถอดด้านล่างออกแล้ว ให้ถอดอุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์ทั้งหมดออกจากแผงควบคุมแล้วถอดแผงควบคุมออก

ขั้นตอนที่ 4: Mount ที่เปลี่ยนได้

Body 1 และ Body 14 ต้องใช้น็อตชุดทำความร้อนสองตัว ตัวเครื่อง 1 ติดตั้งกับโครงเครื่องพิมพ์ด้วยสลักเกลียว M3 สองตัวที่ซ่อนอยู่ใต้สายพาน สามารถเปิดเผยสลักเกลียวได้โดยการถอดตัวปรับความตึงสายพานและดึงสายพานไปด้านใดด้านหนึ่ง

ขั้นตอนที่ 5: สวิตช์แกน Z

สวิตช์แกน Z ถูกจัดตำแหน่งใหม่เพื่อให้สามารถใช้เข็มที่มีความยาวเท่าใดก็ได้ในระหว่างลำดับการกลับบ้านโดยไม่ต้องชดเชยในซอฟต์แวร์ สวิตช์ควรติดตั้งด้วยสกรู M3 2 ตัวที่โครงเครื่องพิมพ์โดยตรงภายใต้หัวพิมพ์ใกล้กับเตียงพิมพ์มากที่สุด

ขั้นตอนที่ 6: การเดินสายไฟ

การเดินสายไฟเป็นไปตามมาตรฐาน Ramps 1.4 เพียงทำตามแผนภาพการเดินสายไฟ ตัดและต่อสายไฟตามความจำเป็นสำหรับแผงขั้วต่อ อาจต้องต่อสายไฟบางส่วน

ขั้นตอนที่ 7: เครื่องอัดรีดอีพ็อกซี่

แม้ว่าเครื่องอัดรีดนี้จะใช้เวลาพิมพ์น้อยกว่า แต่ก็ใช้อีพ็อกซี่ซึ่งเพิ่มเวลาในการสร้างโดยรวมมากกว่า 24 ชั่วโมง แกนเกลียวขนาด 8 มม. ควรเคลือบด้วยอีพอกซีกับตลับลูกปืน 608 และตลับลูกปืนควรเคลือบด้วยอีพ็อกซี่กับชิ้นงานที่พิมพ์ 3 มิติ Body 21 นอกจากนี้ น็อตสำหรับแกนเกลียวควรเคลือบอีพอกซีกับ Body 40 เมื่ออีพ็อกซี่ได้รับการบ่มจนหมด ยาง ทิปจากลูกสูบกระบอกฉีดยาขนาด 60 มล. และ 10 มล. สามารถติดตั้งได้บน Body 9 และ Body 21 ตามลำดับ ไม่พบข้อต่อ T ที่เหมาะสม ดังนั้นจึงทำมาจากท่อทองเหลืองขนาด 6 มม. และตัวประสาน เครื่องอัดรีดทำหน้าที่เป็นระบบไฮดรอลิกที่ผลัก Bioink ออกจากห้องด้านล่างของหลอดฉีดยาขนาด 10 มล. อากาศสามารถขับออกจากระบบได้โดยการเขย่าท่ออย่างแรงในขณะที่จับข้อต่อตัว T ไว้ที่จุดสูงสุด

ขั้นตอนที่ 8: เครื่องอัดรีดแบบวางปกติ

เครื่องอัดรีดนี้สามารถยึดเข้าด้วยกันได้ ข้อเสียของเครื่องอัดรีดนี้คือมันเทอะทะและมีฟันเฟืองสูง

ขั้นตอนที่ 9: ขั้นตอนที่ 9: เฟิร์มแวร์ Arduino

Arduino ต้องการเฟิร์มแวร์เพื่อรันไดรเวอร์ stepper และอุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์อื่นๆ เราเลือก Marlin เนื่องจากเป็นโปรแกรมฟรี ปรับเปลี่ยนได้ง่ายด้วย Arduino IDE และรองรับได้ดี เราได้แก้ไขเฟิร์มแวร์สำหรับฮาร์ดแวร์เฉพาะของเราแล้ว แต่การปรับเปลี่ยนสำหรับเครื่องพิมพ์อื่นๆ นั้นค่อนข้างง่าย เนื่องจากโค้ดทั้งหมดได้รับการแสดงความคิดเห็นและอธิบายไว้อย่างชัดเจน ดับเบิลคลิกที่ไฟล์ MonopriceV2BioprinterFirmware.ino เพื่อเปิดไฟล์การกำหนดค่า marlin

ขั้นตอนที่ 10: โปรไฟล์ Cura

โปรไฟล์ Cura สามารถนำเข้าสู่ Ultimaker Cura 4.0.0 และใช้เพื่อสร้างตาข่ายที่มีพื้นที่ผิวสูงเพื่อใช้ในเครื่องปฏิกรณ์แบบกระจาย การสร้าง Gcode สำหรับเครื่องพิมพ์ยังคงเป็นช่วงทดลองสูงและต้องใช้ความอดทนอย่างมาก สิ่งที่แนบมาด้วยคือ gcode ทดสอบสำหรับเครื่องปฏิกรณ์แบบกลม

ขั้นตอนที่ 11: การเปลี่ยน Start G-code

วางรหัสนี้ลงในการตั้งค่าเริ่มต้น G-code:

G1 Z15

G28

G1 Z20 F3000

G92 Z33.7

G90

M82

G92 E0

ใน Repetier หากต้องการแก้ไข start Gcode ให้ไปที่ slicer->Configuration->G-codes->start G-codes จำเป็นต้องแก้ไขค่า G92 Z สำหรับแต่ละกรณี ค่อยๆ เพิ่มค่าจนกว่าเข็มจะเป็นระยะห่างที่ต้องการจากพื้นผิวจานเพาะเชื้อเมื่อเริ่มพิมพ์

ขั้นตอนที่ 12: การสร้าง Bioink

ขั้นตอนการพัฒนา Bioink ให้เหมาะสมกับการใช้งานนั้นซับซ้อน นี่คือกระบวนการที่เราปฏิบัติตาม:

สรุป

ไฮโดรเจลเหมาะสำหรับเซลล์พืชที่ไวต่อแรงเฉือนและมีรูพรุนแบบเปิดเพื่อให้เกิดการแพร่ ไฮโดรเจลทำขึ้นโดยการละลายอะกาโรส อัลจิเนต เมทิลเซลลูโลส และซูโครสในน้ำปราศจากไอออนและเติมเซลล์ เจลมีความหนืดจนกว่าจะหายขาดด้วยแคลเซียมคลอไรด์ 0.1M ซึ่งทำให้ทนทาน สารละลายสำหรับการบ่มแคลเซียมคลอไรด์เชื่อมขวางกับอัลจิเนตเพื่อให้มีความทนทาน แอลจิเนตเป็นฐานของเจล เมทิลเซลลูโลสจะทำให้เจลเป็นเนื้อเดียวกัน และอะกาโรสมีโครงสร้างมากกว่าเนื่องจากเจลที่อุณหภูมิห้อง ซูโครสเป็นอาหารสำหรับเซลล์ที่จะเติบโตต่อไปในไฮโดรเจล

ภาพรวมโดยย่อของการทดลองบางอย่างเพื่อตรวจสอบเจล

เราทดสอบไฮโดรเจลต่างๆ กับอะกาโรสในปริมาณที่แตกต่างกัน และบันทึกความสม่ำเสมอของไฮโดรเจล พิมพ์ได้ง่ายเพียงใด และไม่ว่าจะจมหรือลอยในสารละลายการบ่ม การลดเปอร์เซ็นต์ของแอลจิเนตทำให้เจลเหลวเกินไป และไม่สามารถคงรูปร่างได้หลังจากพิมพ์ การเพิ่มเปอร์เซ็นต์ของแอลจิเนตทำให้สารละลายการบ่มทำงานได้อย่างรวดเร็ว โดยที่เจลจะบ่มก่อนที่จะเกาะติดกับชั้นบนสุด ไฮโดรเจลที่คงรูปร่างและไม่แข็งตัวเร็วเกินไปได้รับการพัฒนาโดยใช้อัลจิเนต 2.8 โดยน้ำหนัก

วิธีการพัฒนาไฮโดรเจล

วัสดุ

อะกาโรส (0.9 น้ำหนัก %)

อัลจิเนต (2.8 wt %)

เมทิลเซลลูโลส (3.0 wt%)

ซูโครส (3.0 wt%)

แคลเซียมคลอไรด์.1M (147.001 ก./โมล)

ddH20

มวลรวมเซลล์

2 บีกเกอร์ล้างและแห้ง

1 ไม้พายผสม

อลูมิเนียมฟอยล์

กระดาษชั่งน้ำหนักพลาสติก

กระบอกสำเร็จการศึกษา

ขั้นตอน

การทำไฮโดรเจล:

1. วัดปริมาณ ddH20 ที่เฉพาะเจาะจงโดยพิจารณาจากปริมาณเจลที่คุณต้องการเตรียม ใช้กระบอกสูบที่สำเร็จการศึกษาเพื่อให้ได้ปริมาตรเฉพาะของ ddH20
2. สารละลายไฮโดรเจลจะมีแอลจิเนต (2.8 โดยน้ำหนัก %)), อากาโรส(0.9 โดยน้ำหนัก %), ซูโครส (3 โดยน้ำหนัก%) และเมทิลเซลลูโลส (3 % โดยน้ำหนัก) ส่วนที่เหมาะสมของส่วนประกอบของสารละลายไฮโดรเจลจะถูกวัดโดยใช้กระดาษชั่งน้ำหนักแบบพลาสติก
3. เมื่อชั่งน้ำหนักส่วนประกอบทั้งหมดเสร็จแล้ว ให้เติม ddh20, ซูโครส, อากาโรส และโซเดียมอัลจิเนตสุดท้ายลงในบีกเกอร์แบบแห้งตัวใดตัวหนึ่ง คลุกเคล้าให้เข้ากัน แต่อย่าใช้ไม้พายผสมเพราะแป้งจะเกาะติดกับไม้พาย
4. เมื่อผสมกันแล้ว ให้ห่อด้านบนของบีกเกอร์ด้วยฟอยล์อลูมิเนียมให้เรียบร้อย และติดฉลากที่บีกเกอร์ เพิ่มเทปนึ่งฆ่าเชื้อที่ด้านบนของฟอยล์
5. ใส่เมทิลเซลลูโลสที่เหลือลงในบีกเกอร์แห้งอีกใบแล้วห่อด้วยฟอยล์อลูมิเนียมเหมือนบีกเกอร์ก่อนหน้า ติดฉลากบีกเกอร์นี้และเพิ่มเทปนึ่งฆ่าเชื้อที่ด้านบนของฟอยล์
6. ห่อไม้พาย 1 อันในฟอยล์อลูมิเนียมและตรวจดูให้แน่ใจว่าไม่มีไม้สัมผัสถูกเปิดออก เพิ่มเทปนึ่งลงในไม้พายที่ห่อ
7. นึ่งบีกเกอร์ 2 อันและไม้พาย 1 อันที่ 121 C เป็นเวลา 20 นาทีระหว่างรอบการฆ่าเชื้อ อย่าใช้หม้อนึ่งความดันในวงจรปลอดเชื้อและแห้ง
8. เมื่อรอบหม้อนึ่งความดันเสร็จสิ้น ปล่อยให้เจลเย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้อง และเมื่อถึงอุณหภูมิแล้ว ให้เริ่มดำเนินการในตู้ความปลอดภัยทางชีวภาพ
9. อย่าลืมล้างมือและแขนและใช้เทคนิคปลอดเชื้อที่เหมาะสมเมื่อใช้งานในตู้ความปลอดภัยทางชีวภาพ ตรวจสอบให้แน่ใจด้วยว่าอย่าสัมผัสโดยตรงกับวัตถุที่จะสัมผัสเจลหรือใกล้กับเจล (เช่น: ปลายผสมของไม้พายหรือบริเวณอลูมิเนียมฟอยล์ที่อยู่เหนือเจล)
10. ในตู้ความปลอดภัยทางชีวภาพ ผสมเมทิลเซลลูโลสลงในเจลเพื่อให้กระจายตัวเป็นเนื้อเดียวกัน เมื่อผสมเสร็จแล้ว ให้ห่อเจลที่ผสมไว้ด้านบนอีกครั้ง และวางในตู้เย็นค้างคืน
11. จากที่นี่ เจลสามารถใช้สำหรับการแนะนำเซลล์หรือเพื่อการใช้งานอื่นๆ เช่น การพิมพ์

การเพิ่มเซลล์:

1. กรองเซลล์ให้มีขนาดเท่ากัน ขั้นตอนการกรองของเราคือ

   ขูดเซลล์ออกจากจานเพาะเชื้อเบา ๆ และใช้ตะแกรง 380 ไมโครเมตรเพื่อกรองเซลล์

2. ค่อยๆ ผสมเซลล์ที่กรองแล้วในสารละลายไฮโดรเจลโดยใช้ไม้พายหัวแบนเพื่อหลีกเลี่ยงการสูญเสียของผสม (ที่ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อแล้ว)
3. หลังจากผสมเซลล์แล้ว ให้หมุนเหวี่ยงออกฟองสบู่
4. จากที่นี่ ไฮโดรเจลจะสมบูรณ์และสามารถใช้สำหรับการพิมพ์ การบ่ม และการทดลองในอนาคต

วิธีการพัฒนาสารละลายการบ่ม (0.1M แคลเซียมคลอไรด์, CaCl2)

วัสดุ

แคลเซียมคลอไรด์

ddH20

ซูโครส (3 wt %)

ขั้นตอน (การทำน้ำยาบ่ม 1L)

1. วัด 147.01g แคลเซียมคลอไรด์ ซูโครส 30 มล. และ 1 ลิตร ddH20
2. ผสมแคลเซียมคลอไรด์ ซูโครส และ ddH20 ในบีกเกอร์หรือภาชนะขนาดใหญ่
3. แช่เจลในสารละลายบ่มอย่างน้อย 10 นาทีเพื่อรักษา

ขั้นตอนที่ 13: พิมพ์

ตามทฤษฎีแล้ว Bioprinting นั้นง่ายมาก อย่างไรก็ตาม ในทางปฏิบัติ มีหลายปัจจัยที่อาจทำให้เกิดความล้มเหลวได้ ด้วยเจลนี้ เราพบว่ามีหลายสิ่งหลายอย่างที่สามารถทำได้เพื่อเพิ่มความสำเร็จสูงสุดสำหรับการใช้งานของเรา:

1. ใช้สารละลาย CaCl2 จำนวนเล็กน้อยเพื่อรักษาเจลบางส่วนขณะพิมพ์
2. ใช้กระดาษชำระที่ด้านล่างของจานเพาะเชื้อเพื่อเพิ่มการยึดเกาะ
3. ใช้กระดาษทิชชู่เกลี่ย CaCl2 ปริมาณเล็กน้อยให้ทั่วงานพิมพ์
4. ใช้ตัวเลื่อนอัตราการไหลใน Repetier เพื่อค้นหาอัตราการไหลที่ถูกต้อง

สำหรับการใช้งานที่แตกต่างกันและเจลที่แตกต่างกัน อาจต้องใช้เทคนิคที่แตกต่างกัน ขั้นตอนของเราถูกสร้างขึ้นในช่วงหลายเดือน ความอดทนเป็นสิ่งสำคัญ

ขอให้โชคดีถ้าคุณพยายามทำโครงการนี้และอย่าลังเลที่จะถามคำถามใด ๆ

รางวัลที่หนึ่งในการประกวด Arduino 2019